简介

单细胞转录组测序（scRNA-seq）作为解析细胞异质性的核心技术，能够在单个细胞水平上捕获基因表达谱，为生命科学研究及临床应用提供了高分辨率的分子层面视角。以下从技术原理、关键流程、数据分析及应用方向等方面进行详细说明。

一、技术背景与核心优势

传统 bulk RNA-seq 基于细胞群体的基因表达平均水平进行分析，难以捕捉细胞间的异质性。而scRNA-seq可实现单个细胞的转录组检测，其核心优势体现在：

1. 能够识别组织中低丰度细胞类型（如肿瘤微环境中的癌干细胞）；

2 解析细胞分化轨迹及动态基因表达变化；

3. 揭示基因表达的随机性及细胞状态转换机制。

该技术已成为肿瘤学、发育生物学、神经科学等领域的关键研究工具。

二、核心技术原理与流程

（一）单细胞捕获

单细胞捕获是scRNA-seq的首要步骤，需满足高捕获效率、低交叉污染的技术要求。目前主流技术包括：

1. 微流控芯片技术（以10×Genomics Chromium系统为例）

原理：利用微流控通道将单细胞、带有条形码（Cell Barcode）及UMI（Unique Molecular Identifier）的凝胶微珠与反应试剂包裹于油包水液滴（GEMs）中。

技术参数：单次实验可捕获500–100,000个细胞，捕获效率达65%±5%，双细胞率＜0.4%（细胞浓度在700–1200 cells/μL条件下）。

2. 其他捕获方法

流式细胞分选结合孔板接种：适用于低通量需求（＜1000细胞），需严格控制细胞活性（活细胞率＞90%）。

微滴式数字PCR平台：如Drop-seq技术，成本较低但捕获效率相对较低（约20%–30%）。

（二）RNA 逆转录与cDNA扩增

1. 逆转录反应：细胞裂解后释放的RNA与微珠表面的寡核苷酸引物结合，引物包含：Poly (dT)序列（靶向mRNA的3'端 Poly (A) 尾）、Cell Barcode、UMI 及测序接头序列。逆转录酶（如MMLV逆转录酶）催化合成cDNA第一链，UMI 在此过程中与每个mRNA分子特异性结合，用于后续定量校正。

2. cDNA 扩增：采用PCR扩增或体外转录（IVT）线性扩增：PCR扩增适用于多数平台，需控制循环数（通常12–18个循环）以减少扩增偏倚；IVT线性扩增可降低偏好性，但产量相对较低。

3. 质量控制标准：扩增后cDNA浓度需达到5–30 ng/μL，片段分布峰值在1000–2000 bp（Agilent 2100检测）。

（三）文库构建与测序

1. 文库构建

经cDNA片段化、末端修复、加A尾及接头连接后，通过PCR富集构建测序文库。

文库质量要求：片段大小集中在300–500 bp，无接头二聚体，Qubit定量浓度＞2 nM。

2. 高通量测序

推荐测序平台：Illumina NovaSeq 6000或NextSeq 1000/2000。

测序深度设计：

①细胞分群及基础分析：50,000–100,000 reads/细胞；

②高分辨率基因表达分析（如稀有细胞类型鉴定）：150,000–300,000 reads/细胞。

数据产出要求：Q30碱基比例＞85%，均一性误差＜10%。

（四）数据分析流程

1. 原始数据处理

数据拆分：基于Cell Barcode将测序数据分配至对应细胞；

质量过滤：去除含N碱基比例＞5%、低质量碱基（Q＜20）占比＞20%的序列；

UMI 去重：通过UMI计数校正PCR扩增偏差，生成基因表达矩阵。

2. 细胞质量控制

检测基因数：排除＜200或＞6000基因的细胞（排除死细胞或双细胞）；

线粒体基因占比：通常＜20%（避免细胞凋亡导致的RNA降解干扰）；

核糖体基因占比：根据组织类型设定阈值（如免疫细胞通常＞30%）。

3. 标准化与降维分析

标准化方法：采用LogNormalize或SCTransform消除测序深度差异；

降维算法：通过主成分分析（PCA）进行特征提取，选取前20–50个主成分用于后续分析；

可视化：使用UMAP或t-SNE算法进行二维投影，保留局部与全局细胞聚类结构。

4. 细胞聚类与注释

聚类算法：采用Leiden算法（分辨率参数通常设为0.4–1.2）；

细胞注释：基于已知标记基因（Marker Genes）及参考数据库（如CellMarker、PanglaoDB）进行细胞类型注释，可结合单细胞注释工具（如SingleR）实现自动化注释。

5. 差异表达与功能分析

差异基因筛选：使用MAST、DESeq2等算法，设定阈值（|log2FC|＞0.25，Adjusted P-value＜0.05）；

功能富集：通过GO、KEGG数据库进行通路分析，结合SCENIC等工具预测转录调控网络。

三、技术难点与解决方案

1. 低起始量RNA扩增偏差

问题：单个细胞RNA含量仅 10–30 pg，易导致扩增效率差异及基因丢失。

解决方案：采用UMI标签校正定量偏差；优化逆转录体系（如添加RNA酶抑制剂、使用高保真逆转录酶）。

2. 批次效应消除

问题：不同实验批次的测序数据存在系统性偏差。

解决方案：实验设计：采用统一试剂及操作流程；计算校正：使用Harmony、Seurat Integration等算法进行批次效应去除。

3.稀有细胞类型检测

问题：低丰度细胞（占比＜1%）易被聚类算法忽略。

解决方案：提高测序深度至200,000 reads/细胞以上；采用亚群细分算法（如SubCluster分析）。

四、应用领域

1. 肿瘤微环境解析：识别肿瘤浸润免疫细胞亚群（如exhausted T 细胞、M2型巨噬细胞），分析其基因表达特征及与预后的关联。

技术要求：需结合TCR/BCR测序实现免疫细胞克隆型分析。

2. 发育细胞谱系追踪：通过Monocle3等工具重构细胞分化轨迹，鉴定关键分支点及调控基因。

技术要求：需获取时间序列样本或结合谱系示踪技术。

3. 临床样本分析：对穿刺活检样本进行单细胞水平分子分型，指导个体化治疗。

技术要求：样本需新鲜处理（24 h内完成单细胞捕获），或采用单细胞保存液（如10× Genomics Cryopreservation Kit）。

参考文献

[1] https://www.illumina.com.cn/techniques/sequencing/rna-sequencing/ultra-low-Input

-single-cell-rna-seq.html

[2] Zheng G X Y, Terry J M, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat. Commun. 8, 14049[EB/OL].(2017)

[3] Macosko E Z, Basu A, Satija R, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets[J]. Cell, 2015, 161(5): 1202-1214.

[4] Butler A, Hoffman P, Smibert P, et al. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species[J]. Nature biotechnology, 2018, 36(5): 411-420.

[5] Stuart T, Butler A, Hoffman P, Hafemeister C, Papalexi E, Mauck WM, Hao Y, Stoeckius M, Smibert P, Satija R. Comprehensive integration of single-cell data[J]. Cell. 2019 Jun 13;177(7):1888-902.