简介
真核转录组测序（Eukaryotic Transcriptome Sequencing，RNA-Seq）是利用高通量测序技术对真核生物细胞内的所有转录本（mRNA、lncRNA、circRNA等）进行测序和分析的方法。通过RNA-Seq，可以研究基因表达水平、可变剪接、新转录本发现、融合基因检测以及非编码RNA分析等，广泛应用于生物学研究、医学诊断和药物开发等领域。
有参转录组和无参转录组
有参转录组测序（Reference-Based RNA-Seq）是指利用已知的参考基因组进行比对和定量分析，适用于已有高质量基因组的物种。
无参转录组测序（De Novo RNA-Seq）是指在没有参考基因组的情况下，直接对转录本进行测序、组装和注释。适用于缺乏高质量参考基因组的物种。
表1 有参转录组和无参转录组的区别
比较项 | 有参转录组（Reference-Based） | 无参转录组（De Novo） |
依赖参考基因组 | 需要 | 不需要 |
适用物种 | 模式生物、已知基因组物种 如人类、小鼠、拟南芥等 | 非模式生物、新物种 如某些植物、昆虫、海洋生物等 |
组装难度 | 较低（直接比对） | 较高（依赖测序深度和组装算法） |
分析准确性 | 较高（基于参考基因组） | 依赖组装质量 |
常见分析流程 | 1. 数据质控（FastQC、Trimmomatic） 2. 比对到参考基因组（Hisat2、STAR、TopHat2） 3. 基因表达定量（HTSeq、featureCounts） 4.差异表达分析（DESeq2、edgeR） 5.功能富集分析（GO、KEGG） | 1. 数据质控（去除低质量reads和接头序列） 2. 转录本组装（使用Trinity、SOAPdenovo-Trans等工具） 3. 基因功能注释（比对到Nr、Swiss-Prot、KEGG等数据库） 4. 差异表达分析（基于组装转录本进行定量） |
主要应用 | 基因表达分析、可变剪接研究 | 新基因发现、物种进化研究 |
转录组测序的流程
1. 样品采集（血样，胚胎，动植物组织等）：在无RNase环境下完成采集（DEPC水处理耗材，操作台UV灭菌），根据组织特性需要液氮速冻研磨等操作。
2. 总RNA提取：以动物细胞为例，总RNA提取需在无RNase环境下，用TRIzol裂解细胞后经氯仿分层获取水相，异丙醇沉淀RNA并用乙醇洗涤，然后用DEPC水溶解。其质量检测须达到以下标准：
Nanodrop：OD260/280≈2.0（纯净RNA），OD260/230>1.8（无盐污染）
Agilent 2100：RIN≥8（真核样本合格标准）
电泳：28S/18S条带亮度比≈2:1（完整RNA）
3. cDNA建库：用oligo dT磁珠富集带有Poly A尾端的mRNA，将mRNA片段化，反转得到cDNA，链接adapter之后进行扩增。
4. 上机测序：有参转录组常用illumina NovaSeq 6000，无参则可在此基础上与全长测序联合使用以提高组装的准确性，常用PacBio Sequel II/IIe和Oxford Nanopore PromethION。
5. 质控分析达标后，有参转录组可与基因组进行比对，无参转录组则需组装注释。
6. 表达定量分析，更具需求进行差异基因分析、聚类分析和富集分析等。
参考文献
[1]崔凯,吴伟伟,刁其玉.转录组测序技术的研究和应用进展[J].生物技术通报,2019,35(07):1-9.
[2]Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics[J]. Nature reviews genetics, 2009, 10(1): 57-63.
[2]Haas B J, Papanicolaou A, Yassour M, et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis[J]. Nature protocols, 2013, 8(8): 1494-1512.
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